| Analyzing the Quenchable Iron Pool in Murine Macrophages by Flow Cytometry
|
|
Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Tissue-resident macrophages are pivotal for a tightly-regulated iron metabolism at a cellular and systemic level, since subtle iron alterations increase the susceptibility for microbial infections or drive multiple diseases. However, research on cellular iron homeostasis in macrophages remains challenging due to the limited amount of available methods using radioactive 59Fe isotopes or strong iron chelators, which might be inapplicable in certain experimental settings. This protocol describes the analysis of the quenchable iron pool (QIP) in macrophages by loading these cells with ...
[摘要] [摘要 ] 驻留在组织中的巨噬细胞对于在细胞和全身水平上严格调节铁代谢至关重要，因为细微的铁改变会增加对微生物感染的敏感性或引发多种疾病。然而，由于使用放射性59 Fe同位素或强铁螯合剂的可用方法数量有限，因此巨噬细胞中细胞铁稳态的研究仍然具有挑战性，这在某些实验环境中可能不适用。该协议 描述了通过向这些细胞加载外源铁配合物来分析巨噬细胞中的可淬灭铁池（QIP）。因此，由于巨噬细胞的铁摄取能力与细胞内铁水平成反比，因此可以确定细胞质的铁库。因此，该测定法能够准确分析细胞质铁通量的微小变化，并且几乎适用于所有实验室环境。另外，该方案还可以用于体外和体内的其他免疫细胞类型。
[背景 ] 由于用于全身铁代谢它们的中心调节功能，在多种组织中的巨噬细胞中迅速地改变在不同的刺激的遭遇它们的细胞内的铁水平的微生物感染和疾病（Nairz 等人，2017） 。值得注意的是，大多数细胞中的铁离子被细胞质中的主要铁存储蛋白铁蛋白结合或定位于线粒体或溶酶体等区室（Ma 等，2015 ; Soares和Hamza，2016 ...
|
|
|
| CRISPR/Cas Gene Editing of a Large DNA Virus: African Swine Fever Virus
|
|
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Gene editing of large DNA viruses, such as African swine fever virus (ASFV), has traditionally relied on homologous recombination of a donor plasmid consisting of a reporter cassette with surrounding homologous viral DNA. However, this homologous recombination resulting in the desired modified virus is a rare event. We recently reported the use of CRISPR/Cas9 to edit ASFV. The use of CRISPR/Cas9 to modify the African swine fever virus genome resulted in a fast and relatively easy way to introduce genetic changes. To accomplish this goal we first infect primary swine macrophages with a field ...
[摘要] 大型DNA病毒（例如非洲猪瘟病毒（ASFV））的基因编辑传统上依赖于由报道盒组成的供体质粒与周围同源病毒DNA的同源重组。然而，这种导致所需修饰病毒的同源重组是罕见的事件。我们最近报道了使用CRISPR / Cas9编辑ASFV。使用CRISPR / Cas9修饰非洲猪瘟病毒基因组导致了引入遗传变化的快速且相对简单的方法。为了实现这一目标，我们首先用田间分离株ASFV-G感染原代猪巨噬细胞，并用CRISPR / Cas9供体质粒转染质粒，该质粒将表达靶向我们基因的特异性gRNA被删除。通过插入报告盒，我们能够通过有限稀释和噬菌斑纯化从亲本中纯化我们的重组病毒。我们以前曾报道将传统的同源重组方法与CRISPR / Cas9进行比较，结果导致重组增加超过4个对数。
【背景】 非洲猪瘟（ASF）是一种由ASF病毒（ASFV）引起的高度致命的猪传染性病毒性疾病。 ASFV的基因组由大约180-190千碱基对的双链DNA基因组组成。 ASFV引起一系列疾病，从高度致命到亚临床，取决于宿主特征和病毒株（Tulman et al。，2009）。 ASFV没有商业疫苗;实验上，2007年格鲁吉亚爆发的唯一能够抵御目前流行病毒株的疫苗（ASFV-G）是含有一个或多个病毒基因组缺失的减毒活疫苗，例如:( O'Donnell et ...
|
|
|
| Measurement of TLR4 and CD14 Receptor Endocytosis Using Flow Cytometry
|
|
Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] After recognizing extracellular bacterial lipopolysaccharide (LPS), the toll-like receptor 4 (TLR4)-CD14 signaling complex initiates two distinct signaling pathways–one from the plasma membrane and the other from the signaling endosomes (Kagan et al., 2008). Understanding the early stages of TLR4 signal transduction therefore requires a robust and quantitative method to measure LPS-triggered TLR4 and CD14 receptor endocytosis, one of the earliest events of LPS detection. Here, we describe a flow cytometry-based method that we used recently to study the role of the ion channel TRPM7 ...
[摘要] 在识别细胞外细菌脂多糖（LPS）后，Toll样受体4（TLR4）-CD14信号传导复合物启动两种不同的信号传导途径 - 一种来自质膜，另一种来自信号传导内体（Kagan 等。，2008）。因此，了解TLR4信号转导的早期阶段需要一种稳健且定量的方法来测量LPS触发的TLR4和CD14受体内吞作用，这是LPS检测中最早发生的事件之一。在这里，我们描述了一种基于流式细胞术的方法，我们最近用它来研究离子通道TRPM7在TLR4内吞作用中的作用（Schappe et al。，2018）。该测定依赖于用LPS刺激细胞并使用流式细胞术在不同时间点测量TLR4（或CD14）的细胞表面水平。尽管我们详细描述了来自鼠骨髓来源的巨噬细胞的TLR4和CD14的方法，但它可以很容易地适应于在各种其他信号传导环境中评估受体内吞作用。
【背景】先天免疫细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，使用各种模式识别受体（PRR）来调查其环境中的危险和病原体相关分子模式。来自各种亚细胞区室的PRR的贩运和信号传导实现了更广泛的免疫监视，并且已成为先天免疫的重要设计原则（Brubaker et al。，2015）。细菌内毒素LPS的检测高度依赖于TLR4及其共同受体CD14。 TLR4复合物的内吞作用需要CD14，并且对于LPS诱导的巨噬细胞活化是必需的（Zanoni 等人，2011; Tan ...
|
|
|