| Ultradeep Pyrosequencing of Hepatitis C Virus to Define Evolutionary Phenotypes
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Analysis of hypervariable regions (HVR) using pyrosequencing techniques is hampered by the ability of error correction algorithms to account for the heterogeneity of the variants present. Analysis of between-sample fluctuations to virome sub-populations, and detection of low frequency variants, are unreliable through the application of arbitrary frequency cut offs. Cumulatively this leads to an underestimation of genetic diversity. In the following technique we describe the analysis of Hepatitis C virus (HCV) HVR1 which includes the E1/E2 glycoprotein gene junction. This procedure describes ...
[摘要] 使用焦磷酸测序技术的高变区（HVR）分析受到纠错算法解释存在的变异异质性的能力的阻碍。通过应用任意频率切断，对样本间波动与色情子群体的分析以及低频变体的检测是不可靠的。累积地导致遗传多样性的低估。在以下技术中，我们描述了包含E1 / E2糖蛋白基因连接的丙型肝炎病毒（HCV）HVR1的分析。该程序描述了HCV在治疗初始环境中的演变，从10年来收集的10个样品中，使用在Roche GS FLX钛平台上进行的超深度焦磷酸测序（UDPS）（2014年，Palmer等人） 。使用血清样品的初步克隆分析来通知允许达到更大序列深度的下游误差校正算法。已经针对HCV基因型1,2,3和4测试了该区域的PCR扩增。
背景 衍生自病毒扩增子的UDPS数据集的分析经常依赖于未针对扩增子分析进行优化的软件工具，假设随机并入测序突变，并且集中在找到真实序列而不是假变异体。存在于RNA病毒基因组中的高变区存在这些困难。许多利用UDPS的研究通过对数据应用任意的频率切断来寻求解决这些问题，从而导致小的变体的丢失。在这里，暂时匹配的克隆数据集以及旨在克服所概述的问题的纠错方法，有助于保留有价值的序列信息。
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| Mismatched Primer Extension Assays
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Author:
Date:
2015-06-20
[Abstract] Steady state kinetic assays have been a reliable way to estimate fidelity of several polymerases (Menendez-Arias, 2009; Rezende and Prasad, 2004; Svarovskaia et al., 2003). The ability to analyze the extension of primers with specific mismatches at the 3ʹ end is a major strength of the mismatched primer extension assays. Recently, we used the mismatched primer extension assays to show that the fidelity of HIV RT increases dramatically when concentration of Mg2+ is reduced to a physiologically relevant concentration (~0.25 mM) (Achuthan et al., 2014). Here, we ...
[摘要] 稳态动力学测定法是估计几种聚合酶的保真度的可靠方法（Menendez-Arias，2009; Rezende和Prasad，2004; Svarovskaia等人，2003）。分析具有在3'末端的特异性错配的引物的延伸的能力是错配引物延伸测定的主要强度。最近，我们使用错配的引物延伸测定法显示当Mg 2+浓度降低到生理相关浓度（〜0.25mM）时，HIV RT的保真度显着增加（Achuthan等al 。，2014）。在这里，我们详细地描述如何进行错配引物延伸测定以使用人类免疫缺陷病毒逆转录酶（HIV RT）在2mM Mg 2+ 2 + 测量标准延伸效率。然后可以使用标准延伸效率估计聚合酶的相对保真度。这里描述的测定基于在Mendelman等人（1990）中公开的方法。
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| Primer Extension Reactions for the PCR- based α- complementation Assay
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Author:
Date:
2015-06-20
[Abstract] The PCR- based- α- complementation assay is an effective technique to measure the fidelity of polymerases, especially RNA-dependent RNA polymerases (RDRP) and Reverse Transcriptases (RT). It has been successfully employed to determine the fidelity of the poliovirus polymerase 3D-pol (DeStefano, 2010) as well as the human immunodeficiency virus Reverse Transcriptase (HIV RT) (Achuthan et al., 2014). A major advantage of the assay is that since the PCR step is involved, even the low yield of products obtained after two rounds of low yield of RNA synthesis (for RDRP) or reverse ...
[摘要] 基于PCR的α-互补分析是测量聚合酶，特别是RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）和逆转录酶（RT）的保真度的有效技术。它已经成功地用于确定脊髓灰质炎病毒聚合酶3D-pol（DeStefano，2010）以及人类免疫缺陷病毒逆转录酶（HIV RT）的保真度（Achuthan等人，2014）。该测定法的主要优点是，由于涉及PCR步骤，甚至可以使用该测定法测量在两轮低合成RNA合成（对于RDRP）或逆转录（对于RT）后获得的产物的低产率。该测定也模拟逆转录过程，因为进行RNA和DNA指导的RT合成步骤。我们最近使用该测定法显示在生理相关镁浓度下的HIV RT具有与其它逆转录酶相同范围内的准确度（Achuthan等人，2014）。在这里，我们详细描述如何使用引物延伸反应准备插入。然后在基于PCR的α-互补分析中进一步处理制备的插入片段。
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