| RNA-protein UV-crosslinking Assay
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] RNA-protein interactions play a crucial role in every aspect of RNA metabolism, and also plays a major role in post-transcriptional gene regulation. RNA-binding proteins have been implicated in viral gene expression (Ray and Das, 2002) and microRNA-mediated gene regulation (Poria et al., 2016). Here we have described the protocol which (1) covalently links transiently interacting RNA-protein complexes by UV crosslinking, (2) removes the unprotected RNA by RNase digestion and (3) detects the RNA-protein complexes by SDS-PAGE analysis. This protocol provides a rapid and reliable means ...
[摘要] RNA-蛋白质的相互作用在RNA代谢的各个方面发挥着至关重要的作用，并且在转录后基因调控中起重要作用。 RNA结合蛋白涉及病毒基因表达（Ray和Das，2002）和微小RNA介导的基因调控（Poria等人，2016）。这里我们描述了（1）通过紫外线交联共价连接瞬时相互作用的RNA蛋白复合物的方案，（2）通过RNA酶消化去除未保护的RNA，（3）通过SDS-PAGE分析检测RNA-蛋白复合物。该方案提供了一种快速可靠的手段来直接测定RNA-蛋白质相互作用及其使用纯化蛋白质的动力学，也有助于鉴定新的RNA-蛋白质相互作用
背景 RNA-蛋白质相互作用由瞬时非共价相互作用介导，例如RNA和蛋白质分子中特异残基之间的静电相互作用和氢键。短波UV辐射可以诱导两个紧密放置的芳环之间的共价键形成。在蛋白质和核酸的含氮碱基中的几个氨基酸中发现芳环结构。因此，使用紫外线照射共价连接RNA和相互作用的蛋白质，从而可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析RNA蛋白复合物。该协议描述了一种简单快速的测定系统，可以在体外测定RNA-蛋白质相互作用及其结合动力学。此外，通过该方法获得的荧光标记的RNA-蛋白复合物的质谱分析可以导致新型RNA-蛋白质相互作用的鉴定。
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| Telomerase Repeated Amplification Protocol (TRAP)
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] Telomeres are found at the end of eukaryotic linear chromosomes, and proteins that bind to telomeres protect DNA from being recognized as double-strand breaks thus preventing end-to-end fusions (Griffith et al., 1999). However, due to the end replication problem and other factors such as oxidative damage, the limited life span of cultured cells (Hayflick limit) results in progressive shortening of these protective structures (Hayflick and Moorhead, 1961; Olovnikov, 1973). The ribonucleoprotein enzyme complex telomerase- consisting of a protein catalytic component hTERT and a ...
[摘要] 端粒存在于真核线性染色体的末端，并且结合端粒的蛋白质保护DNA不被识别为双链断裂，从而防止端对端融合（Griffith等人，1999） 。然而，由于末端复制问题和其他因素如氧化损伤，培养细胞的有限寿命（Hayflick极限）导致这些保护结构的逐渐缩短（Hayflick和Moorhead，1961; Olovnikov，1973）。由蛋白质催化组分hTERT和功能性RNA组分hTR 或组成的核糖核蛋白酶复合物端粒酶端粒酶通过添加端粒重复来抵消端粒缩短到约90％的原发性人类肿瘤和一些短暂增殖的干样细胞中染色体的末端（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。这导致细胞的连续增殖，这是癌症的标志。因此，端粒生物学在衰老，癌症进展/转移以及靶向癌症治疗中具有中心作用。端粒生物学中常用的方法如端粒限制性片段（TRF）（Mender和Shay， 2015b），端粒重复扩增方案（TRAP）和端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析（Mender和Shay，2015a）。在这个详细的协议中，我们描述端粒重复扩增协议（TRAP）。 ...
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| Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] While telomerase is expressed in ~90% of primary human tumors, most somatic tissue cells except transiently proliferating stem-like cells do not have detectable telomerase activity (Shay and Wright, 1996; Shay and Wright, 2001). Telomeres progressively shorten with each cell division in normal cells, including proliferating stem-like cells, due to the end replication (lagging strand synthesis) problem and other causes such as oxidative damage, therefore all somatic cells have limited cell proliferation capacity (Hayflick limit) (Hayflick and Moorhead, 1961; Olovnikov, 1973). The progressive ...
[摘要] 虽然端粒酶在约90％的原发性人类肿瘤中表达，但除了瞬时增殖的干细胞样细胞之外，大多数体细胞组织细胞不具有可检测的端粒酶活性（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。由于末端复制（滞后链合成）问题和其它原因例如氧化损伤，端粒在正常细胞中的每个细胞分裂（包括增殖的干细胞样细胞）逐渐缩短，因此所有体细胞具有有限的细胞增殖能力（Hayflick极限） （Hayflick和Moorhead，1961; Olovnikov，1973）。渐进性端粒缩短最终导致正常细胞中的生长停滞，其被称为复制衰老（Shay等人，1991）。一旦端粒酶在癌细胞中被激活，通过在染色体末端添加TTAGGG重复来稳定端粒长度，从而使细胞分裂无限延续（Shay和Wright，1996; Shay和Wright，2001）。因此，衰老和癌症之间的联系可以部分地解释端粒生物学。有许多快速和方便的方法来研究端粒生物学，例如端粒限制性片段（TRF），端粒重复扩增方案（Telomere Repeat Amplification Protocol， TRAP）（Mender and Shay，2015b）和端粒功能障碍诱导Foci（TIF）分析 ...
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