| Measurement of RNA-induced PKR Activation in vitro
|
|
Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Protein kinase R (PKR) is one of the key RNA-activated sensors for innate immunity. PKR is activated by pathogenic or aberrant RNAs such as short double-stranded RNAs or those with imperfect secondary structures, as well as a reduction in the amount and number of RNA modifications. Activation of PKR may be an underlying mechanism for the pathogenesis of human diseases. In this protocol, I describe a method for studying levels of RNA-induced PKR activation in vitro.
[摘要] 蛋白激酶R（PKR）是先天免疫的核心RNA激活传感器之一。 PKR由致病性或异常RNA如短双链RNA或具有不完全二级结构的RNA激活，以及RNA修饰的量和数量的减少。 PKR的激活可能是人类疾病发病机制的潜在机制。在本协议中，我描述了一种在体外研究RNA诱导的PKR激活水平的方法。
背景 PKR是四种哺乳动物激酶之一，其响应于应激信号磷酸化真核起始因子2-α亚基（eIF2α）。 PKR主要是响应于病毒感染而激活（Holcik和Sonenberg，2005）。 PKR是识别和结合病原RNA的先天免疫的关键组成部分。 RNA与PKR的相互作用促进并稳定其二聚化。然后PKR经历自身磷酸化，随后磷酸化eIF2α以切断一般翻译，同时激活下游信号级联，包括增加的ATF4应激反应转录因子的翻译（Hinnebusch，2005）。
＆nbsp;已知PKR被短双链RNA激活（Manche等人，1992; Zheng和Bevilacqua，2004）以及具有一些不完全二级结构的RNA，例如发夹环（Bevilacqua 等人，1998）。此外，RNA生物发生缺陷，包括较低水平的m ...
|
|
|
| Endolysin Expression, Purification and Activity Determination by Zymography
|
|
Author:
Date:
2014-08-20
[Abstract] Endolysins are peptidoglycan-degrading (muralytic) enzymes produced by many bacteriophages for cell lysis of the host bacterium. The enzymatic activity of muralytic enzymes can be assayed qualitatively using a zymogram containing incorporated peptidoglycan. This protocol describes the expression of a recombinant 6x His-tagged endolysin using an Escherichia coli (E. coli) expression system and native affinity purification of the protein using Ni-NTA agarose. For the zymogram, the protocol details isolation of crude peptidoglycan from the Gram-negative bacterium Rhodobacter ...
[摘要] 内溶素是由许多噬菌体产生的用于细菌裂解宿主细菌的肽聚糖降解（muralytic）酶。可以使用含有掺入的肽聚糖的酶谱定性测定壁溶酶的酶活性。该方案描述了使用大肠杆菌（大肠杆菌）表达系统和使用Ni-NTA琼脂糖的蛋白质的天然亲和纯化的重组6x His-标记的细胞内溶素的表达。对于酶谱，方案详述了粗制肽聚糖从革兰氏阴性细菌红细菌菌体的分离和纯化蛋白质和粗细胞裂解物的酶谱。建筑。简要描述了大肠杆菌BL21（DE3）pET28-a（+）衍生的内溶素表达系统。本文所述的方案针对由荚膜红细菌使用的细胞内溶素555开发和优化，噬菌体样基因转移试剂（RcGTA）（Westbye等人，2013），并研究RcGTA的蛋白P14的干扰活性（Fogg等人， ，2012），但应该是可转移的，作为一个一般的协议，以表达和研究各种细胞内溶素。
|
|
|