| Expression and Purification of Recombinant Skd3 (Human ClpB) Protein and Tobacco Etch Virus (TEV) Protease from Escherichia coli
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Skd3 (encoded by human CLPB) is a mitochondrial AAA+ protein comprised of an N-terminal ankyrin-repeat domain and a C-terminal HCLR-clade nucleotide-binding domain. The function of Skd3 has long remained unknown due to challenges in purifying the protein to high quality and near homogeneity. Recently we described Skd3 as a human mitochondrial protein disaggregase that solubilizes proteins in the mitochondrial intermembrane space. This protocol overcomes the challenges associated with purifying Skd3 and allows for in depth in vitro study of Skd3 activity. Tobacco etch virus (TEV) protease is ...
[摘要] [摘要] Skd3（由人类CLPB编码）是一种线粒体AAA +蛋白，由N末端锚蛋白重复域和C末端HCLR分支核苷酸结合域组成。由于在纯化蛋白质达到高质量和接近均质性方面的挑战，Skd3的功能长期未知。最近，我们描述Skd3作为人类线粒体蛋白disaggregase ，在线粒体膜间间隙增溶蛋白。该协议克服了与纯化Skd3相关的挑战，并允许对Skd3活性进行深入的体外研究。Skd3的纯化需要烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶。因此，我们还描述了如何净化高质量TEV蛋白酶可用于纯化Skd3，其他纯化方案以及需要TEV蛋白酶的体外测定。
[背景] Skd3是一种线粒体AAA +蛋白，与多系统线粒体疾病VII型3-甲基谷氨酸酸尿症（MGCA7）有关（Capo-Chichi等人，2015； Kanabus等人，2015； Saunders等人，， 2015; Wortmann等人，2015 ; Kiykim等人，2016 ）。由于在体外研究Skd3的能力有限，因此对生物学功能和这些突变对Skd3活性的影响的研究仍难以捉摸（Cupo和Shorter，2020； ...
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| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
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| Purification of a Protein Exhibiting Isoleucine 2-epimerase Activity from Lactobacillus otakiensis JCM 15040
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Author:
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2015-10-20
[Abstract] Prominent accumulation of D-leucine, D-allo-isoleucine and D-valine was observed in the culture medium of the heterofermentative bacterial species, Lactobacillus otakiensis (L. otakiensis) JCM 15040. The racemase enzyme that resulted in this accumulation, isoleucine 2-epimerase, was purified from the bacterial cells. This is the first reported observation of such production of D-branched chain amino acids in lactic acid bacteria, and the first example of a racemase with isoleucine 2-epimerase activity in any organisms. In the described protocol, we introduce methods ...
[摘要] 在异质发酵细菌物种，例如otakiensis的乳酸杆菌（Lactobacillus otakiensis）的培养基中观察到D-亮氨酸，D-异亮氨酸 - 异亮氨酸和D-缬氨酸的显着积累。 otakiensis）JCM 15040.从细菌细胞中纯化导致这种积累的消旋酶，异亮氨酸2-差向异构酶。这是首次报道的在乳酸菌中这种D-支链氨基酸的产生的观察结果，以及在任何生物体中具有异亮氨酸2-差向异构酶活性的消旋酶的第一个实例。在所述的方案中，我们介绍从L中纯化该蛋白质的方法。因为没有鉴定到对该酶具有高亲和力的特异性配体，所以使用硫酸铵级分，四种类型的柱层析和制备型Native-PAGE，不使用亲和柱层析进行纯化。我们希望协议将提供有用的信息用于纯化不能容易地使用亲和柱层析纯化的酶。
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