| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
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| RNA Immunoprecipitation (RIP) Sequencing of Pri-miRNAs Associated with the Dicing Complex in Arabidopsis
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Date:
2018-07-05
[Abstract] RNA immunoprecipitation (RIP) is an antibody-based technique used to map in vivo RNA-protein interactions. DBR1, an RNA debranching enzyme, is responsible for the debranching of lariat RNA, for the degradation and turnover of lariat RNAs. It is well known that primary miRNA (Pri-miRNA) is recognized and further processed into mature miRNA by the Dicing complex mainly composed of DCL1 and HYL1. Due to the low abundance of pri-miRNAs, RIP followed qRT-PCR has been widely used to evaluate the binding efficiency of the Dicing complex with pri-miRNAs in previous studies. Therefore, the ...
[摘要] RNA免疫沉淀（RIP）是一种基于抗体的技术，用于绘制体内 RNA-蛋白质相互作用。 DBR1是一种RNA脱支酶，负责套索RNA的脱支，用于套索RNA的降解和转换。众所周知，主要miRNA（Pri-miRNA）被主要由DCL1和HYL1组成的切割复合物识别并进一步加工成成熟miRNA。由于pri-miRNA的丰度较低，RIP随后的qRT-PCR已被广泛用于评估切割复合物与pri-miRNA在先前研究中的结合效率。因此，缺乏对具有pri-miRNA的切割复合物的全基因组评估。随着高通量测序技术的改进，我们成功地使用RIP-seq比较了Dicing复合物与野生型和 dbr1-2 突变体之间的pri-miRNA的结合效率。 。在该方案中，我们提供了在两种不同基因型之间的HYL1-YFP和DCL1-YFP转基因植物中使用GFP捕获珠的RIP-seq的详细描述。该方法可用于评估pri-miRNA与拟南芥中的切割复合物的结合，并且它可以应用于植物中的其他RNA结合蛋白。
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| Expression, Purification and in vitro Enzyme Activity Assay of Plant Derived GTPase
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Date:
2015-11-20
[Abstract] Based on gene expression data after biotic stress, the GTPase RabA4c has been suggested to regulate pathogen-induced callose biosynthesis in the model organism Arabidopsis thaliana. We studied the function of RabA4c in its native and dominant negative (dn) isoform. In planta, RabA4c overexpression prevented penetration of the virulent powdery mildew Golovinomyces cichoracearum into epidermal leaf cells. This penetration resistance was caused by enhanced callose deposition at sites of attempted fungal penetration at early time points of ...
[摘要] 基于生物胁迫后的基因表达数据，已经建议GTP酶RabA4c 在模拟生物拟南芥中调节病原体诱导的胼lose质生物合成。我们研究了其天然和显性负性（dn）同种型中的RabA4c 的功能。 ，RabA4c 过表达阻止了毒性白粉病菌向鸡冠状叶细胞的侵入。这种穿透阻力是由于在感染早期试图真菌穿透的部位处的胼cal质沉积增加引起的。相反，RabA4c（dn）过表达不增加胼cal质沉积或穿透抗性。在本方案中，我们描述了异源表达的GTPase RabA4c的表达，纯化和活性测定从 thaliana ，基于出版物Ellinger 等人（2014）。我们将< em> RabA4c</em>与荧光团mCitrine融合，并在酵母菌株巴斯德毕赤酵母GS115中表达该蛋白质。为了纯化RabA4c，我们使用特异性结合GFP衍生物如mCitrine的GFP-Trap_A 试剂盒（Chromo Tek）。通过使用来自Innova Biosciences的 GTPase测定试剂盒进行酶活性测定。一般来说，我们遵循制造商的指示。
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