| Isolation and Maintenance of Striatal Neurons
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Primary cultures of murine striatal neurons are widely used to explore cellular mechanisms in neurobiology, including brain diseases. Here we describe a detailed and standardized protocol to dissect and culture embryonic murine striatal neurons GABA-positive/DARPP-32-positive for 12 days in vitro, when they show good neuronal cell connectivity and the presence of dendritic spines, which reflects the maturation of the network.
[摘要] 小鼠纹状体神经元的原代培养物被广泛用于探索神经生物学中的细胞机制，包括脑部疾病。 在这里，我们描述了一个详细和标准化的协议解剖和文化胚胎小鼠纹状体神经元GABA阳性/ DARPP-32阳性12天体外，当他们显示良好的神经元细胞连接性和存在的树突 刺，反映了网络的成熟。
【背景】纹状体是运动和奖励系统的重要组成部分，纹状体神经元的功能障碍可导致各种神经元疾病，从强迫性行为（Welch et al。，2007）到神经退行性疾病，如在亨廷顿病中观察到的（Reiner等，1988）。因此，一个良好建立的纹状体文化可能是一个很有价值的研究这些和其他条件的模型。成年纹状体中的主要神经元亚型是中型多刺投射神经元（MSNs），其占所有纹状体神经元的约95％并使用抑制性递质γ-氨基丁酸（GABA）。它们具有中等大小的细胞体，复杂的树突状乔木和高密度的树突棘，可同时接受谷氨酸能和多巴胺输入。其余5％的神经元由GABA能神经间神经元组成（Graveland和DiFiglia，1985; ...
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| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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| Analysis of Direct Interaction between Viral DNA-binding Proteins by Protein Pull-down Co-immunoprecipitation Assay
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol analyzes the direct interaction between two DNA-binding proteins by pull-down co-immunoprecipitation. One of the proteins is overexpressed in E. coli as HA-tagged recombinant protein and cell-free extracts are immunoprecipitated in HA-affinity resin. Cell extracts are treated with nuclease to degrade DNA and RNA, which rules out nucleic acid-mediated indirect interaction. Then, a second immunoprecipitation step is performed using the purified putative partner protein. Co-immunoprecipitated proteins can be detected either by Coomassie Blue staining and/or Western ...
[摘要] 该协议通过下拉共免疫沉淀分析两种DNA结合蛋白之间的直接相互作用。其中一种蛋白在E中过表达。如HA标记的重组蛋白和无细胞提取物在HA亲和树脂中免疫沉淀。用核酸酶处理细胞提取物以降解DNA和RNA，这排除了核酸介导的间接相互作用。然后，使用纯化的推定的配偶体蛋白进行第二次免疫沉淀步骤。如果特异性抗体可用，可以通过考马斯蓝染色和/或Western印迹（WB）检测免疫共沉淀蛋白质。此外，许多DNA / RNA结合蛋白具有高度正电性，在标准条件下可阻碍WB，正如组蛋白和组蛋白样蛋白所示。在这种情况下，我们表明，假定的合作伙伴的高等电点导致转移不良。提示麻烦WB提供高正电荷DNA结合蛋白的转移。
【背景】共免疫沉淀是分析蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）的常用方法。许多共免疫沉淀方案使用细菌表达的蛋白质。然而，细胞提取物的使用不排除由第三种蛋白介导的间接相互作用，或者在DNA / RNA结合蛋白的情况下介导核酸。
乙型病毒Bam35（B35TP）的末端蛋白含有保守的酪氨酸194，其提供OH基团以在蛋白质引发的DNA复制期间锚定病毒基因组的第一个5'-dTMP。此外，B35TP具有很强的DNA结合能力，与许多DNA结合蛋白一样，它具有非常高的等电点（约10.6），这影响其体外稳定性和功能（Berjón-Otero 等），2016）。 ...
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