| Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the ...
[摘要] 在该协议中，我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白（氨基酸384-661）的胞外域的产生和纯化，其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达，但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中，我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化，因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象，并且大量生产，每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒（HCV）是全世界慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因（Major et al。，2001; Alter，2006）。此时，没有HCV疫苗，抗病毒药物用于治疗HCV感染（Imran et al。，2014）。然而，治疗费用昂贵且不是100％有效（Kohli et al。，2014）。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用，因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集，先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质，并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子（Flint ...
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| Trimolecular Fluorescence Complementation (TriFC) Assay for Direct Visualization of RNA-Protein Interaction in planta
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] RNA-Protein interactions play important roles in various eukaryotic biological processes. Molecular imaging of subcellular localization of RNA/protein complexes in plants is critical for understanding these interactions. However, methods to image RNA-Protein interactions in living plants have not yet been developed until now. Recently, we have developed a trimolecular fluorescence complementation (TriFC) system for in vivo visualization of RNA-Protein interaction by transient expression in tobacco leaves. In this method, we combined conventional bimolecular fluorescence ...
[摘要] RNA-蛋白质相互作用在各种真核生物过程中起重要作用。 RNA /蛋白质复合物在植物中亚细胞定位的分子成像对于理解这些相互作用至关重要。然而，到目前为止，尚未开发在活植物中形成RNA-蛋白质相互作用的方法。最近，我们开发了一种三分子荧光互补（TriFC）系统，用于在烟草叶中瞬时表达的RNA-蛋白质相互作用的体内可视化。在这种方法中，我们将传统的双分子荧光互补（BiFC）系统与MS2系统（噬菌体MS2外壳蛋白[MCP]及其结合RNA序列[MS2序列]）（Schonberger等人，2012）相结合， 。目标RNA用6xMS2标记，MCP和RNA结合蛋白与YFP片段融合。编码这种融合RNA和蛋白质的DNA构建体用土壤杆菌悬浮液渗入烟草叶中。通过共焦显微镜观察体内的RNA-蛋白质相互作用
【背景】近来，多种类型的长非编码RNA（lncRNA）已经被鉴定并显示出在转录调节和染色质修饰中起重要作用（St Laurent等人，2015）。到目前为止，lncRNA介导的功能的大多数分子机制与RNA-蛋白质相互作用密切相关（St ...
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| Bacterial Survival in Dictyostelium
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Author:
Regin Rønn, Xiuli Hao, Freja Lüthje, Nadezhda A. German, Xuanji Li, Fuyi Huang, Javan Kisaka, David Huffman, Hend A. Alwathnani, Yong-Guan Zhu and Christopher Rensing,
Date:
2017-07-05
[Abstract] We performed an assay to test the ability of different E. coli strains to survive inside amoebal cells after ingestion. In the assay we incubated bacteria together with cells of Dictyostelium discoideum for six hours. After co-incubation most of the uningested bacteria were removed by centrifugation and the remaining uningested bacteria were killed by gentamicin. Gentamicin is used because it does not penetrate into eukaryotic cells allowing the ingested bacteria to survive the antibiotic treatment, whereas bacteria outside the amoebal cells are killed.
[摘要] 我们进行了一个测试来测试不同E的能力。 大肠杆菌菌株在摄入后在变形细胞内存活。 在测定中，我们将细菌与迪氏底盘藻细胞一起培养6小时。 共培养后，通过离心除去大部分未染色的细菌，剩余的未染色细菌被庆大霉素杀死。 使用庆大霉素，因为它不会渗透到真核细胞中，允许摄取的细菌在抗生素治疗中存活，而在变形细胞外的细菌被杀死。
【背景】细菌已经发展了几种不同的策略来避免或抵抗原生动物的捕食（Rønn等人，2012）。减少摄入机会，如增加细胞大小，聚集，生物膜形成和增加游泳速度的机制有充分的记录（Matz和Kjelleberg，2005;Rønn等人，2012），而机制允许细菌摄入后原生动物食物空泡中抵抗消化较少研究（龚等人，2016）。在这里，我们描述了一种方法来研究细菌菌株在通过社会变形虫的盘根盘菌摄入后存活的能力。我们使用这种测定法来研究铜是否耐药。大肠杆菌摄入后的生存机会比没有铜抗性的细菌更高（郝等，2016）。我们研究了铜电阻，因为已知巨噬细胞是在脊椎动物的免疫系统中具有重要作用的吞噬细胞，使用铜来杀死吞噬细胞中的细菌（Hodgkinson和Petris，2012）。我们假设这种杀伤机制最初是在多细胞生命发生之前自由生存的原生动物中发生的，因此铜抗性可能是保护细菌免受原生动物捕食的一个因素。
该测定法是用于评估巨噬细胞杀死细菌的能力的庆大霉素保护测定的修饰（参见例如，，Kaneko等人，2016），并且它利用庆大霉素不能渗入真核细胞。在原始测定中，在两个时间点确定巨噬细胞中的内化细菌细胞的数量。首先，将巨噬细胞与细菌一起培养给定的时间段，并且在这种共培养之后，去除未经检测的细菌并估计内化细菌的数量。巨噬细胞在没有细胞外细菌的情况下进行第二次测量，以使其消化内源性细菌。这两个估计之间的比率是细菌存活率的量度。 ...
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