Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
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Date:
2018-07-05
[Abstract] Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate ...
[摘要] 在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后,天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中,我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX,其导致最佳转化率(1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA)。 在此,提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。
【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程,之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态(Seitz和Blokesch,2013; Blokesch,2016)。群体感应系统,如 comCDE 或 comRS ,控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活(Håvarstein et al。,1995; Pestova et al。,1996; Kleerebezem et al。,1997b; Fontaine et al。,2015)。更具体地说, comC 和 comS 编码信息素,而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器(Håvarstein et al。,1995; ...
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Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交(FISH)是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移(FRET)相结合时,FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同,FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针,并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者,可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份,而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现,以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号(Raj和Tyagi,2010)。但是,在某些情况下,转录本上有特征,例如剪接变体或替代起始位点,这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针,可以使用FRET对定位结合的任一侧,同时定量多达三种mRNA同种型,例如,具有两种探针的同种型(FRET),具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且,可以使用FRET对(Wadsworth等人,2017)来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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Single-probe RNA FISH in Yeast
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Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交(FISH)技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而,许多情况下,如转录本短于200 nt,剪接变异,或创建转录本的替代起始位点,这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此,我们调整了标准FISH方案,以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外,该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交(smFISH)可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号(Raj和Tyagi,2010)。 使用该方案,不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而,在大多数实验中,绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列,可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时,单个探针的检测效率大于50%(Wadsworth等人,2017)。
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