An in vitro Co-culture System for the Activation of CD40 by Membrane-presented CD40 Ligand versus Soluble Agonist
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] One fundamental property of the TNR receptor (TNFR) family relates to how ‘signal quality’ (the extent of receptor ligation or cross-linking) influences the outcome of receptor ligation, for instance the induction of death in tumour cells. It is unequivocal that membrane-presented ligand (delivered to target cells via cell-surface presentation by co-culture with ligand-expressing third-party cells) induces a greater extent of carcinoma cell death in vitro in comparison to non-cross-linked agonists (agonistic antibodies and/or recombinant ligands). The CD40 receptor epitomises this ...
[摘要] TNR受体(TNFR)家族的一个基本特性涉及“信号质量”(受体连接或交联的程度)如何影响受体连接的结果,例如肿瘤细胞中的死亡诱导。毫无疑问,膜呈递配体(通过与表达配体的第三方细胞共培养通过细胞表面呈递递送至靶细胞)在体外诱导更大程度的癌细胞死亡非交联激动剂(激动性抗体和/或重组配体)。 CD40受体集中体现了TNF受体 - 配体相互作用的这种基本特性,因为CD40交联的程度决定了细胞命运。膜呈递CD40配体(mCD40L),但不是可溶性激动剂(例如,激动性抗CD40抗体),诱导高水平的促炎细胞因子分泌并导致恶性肿瘤细胞广泛死亡(细胞凋亡)但不是正常的)上皮细胞。在本文中,我们描述了通过mCD40L激活CD40并随后检测细胞凋亡的各种特征(包括细胞膜透化,DNA片段化,半胱天冬酶活化)以及细胞内细胞死亡介质检测的共培养系统(包括衔接蛋白,促凋亡激酶和活性氧,ROS)。
【背景】TNFR及其配体在调节淋巴组织以及上皮(尤其是癌)细胞中的细胞增殖或死亡中的作用已经在广泛研究中,因为它们诱导细胞死亡(主要通过细胞凋亡)的能力代表了有希望的目标。用于癌症治疗。然而,重要的是,当以可溶性对膜结合形式存在时,TNFR激动剂引发细胞死亡的能力存在明显差异。当作为单独治疗施用时,可溶性激动剂通常表现出相对低的细胞毒性效力,而膜呈递的配体似乎是优越的(Albarbar ...
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An Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) System for Targeted Destruction of Endogenous Proteins
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Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白(POI)的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹(AdPROM)系统(Fulcher等人,2016和2017)。 AdPROM由Von Hippel Lindau(VHL)蛋白组成,Cullin 2 E3连接酶底物受体(Bosu and Kipreos,2008),与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂(如骆驼科纳米抗体)缀合。当在细胞中引入时,靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集,我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体(Sharm等人,2013; Fridy等人。,2014; Schmidt et al。,2016)。在此协议中,我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征,并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性,这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联,而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。 【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计,构建和表达AdPROM VHL-nano ...
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Ubiquitin Proteasome Activity Measurement in Total Plant Extracts
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Date:
2017-09-05
[Abstract] The fine-tuned balance of protein level, conformation and location within the cell is vital for the dynamic changes required for a cell to respond to a given stimulus. This requires the regulated turnover of damaged or short-lived proteins through the ubiquitin proteasome system (UPS). Thus, the protease activity of the proteasome is adjusted to meet the current demands of protein degradation via the UPS within the cell. We describe the adaptation of an intramolecular quenched fluorescence assay utilizing substrate-mimic peptides for the measurement of proteasome activity in total plant ...
[摘要] 细胞内的蛋白质水平,构象和位置的微调平衡对于细胞对给定刺激作出反应所需的动态变化是至关重要的。 这需要通过泛素蛋白酶体系统(UPS)调节受损或短寿命蛋白质的周转。 因此,调节蛋白酶体的蛋白酶活性以满足目前通过细胞内的UPS的蛋白质降解的需求。 我们描述了使用底物 - 模拟肽进行分子内淬灭荧光测定来测定总植物提取物中蛋白酶体活性的适应性。 肽底物含有侧向于剪切键的供体 - 猝灭剂对。 切割后,随后随时测量产物的去质子供体发射的增加,并用于计算相对蛋白酶体活性。 【背景】泛素蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞中主要的蛋白质降解机制,因此,UPS对许多细胞过程的调节至关重要,包括信号传导,细胞周期,囊泡运输和免疫。用于营业额的蛋白质通过泛素的共价连接标记,然后被26S蛋白酶体降解。 26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成,即20S核心蛋白酶(CP),其分隔蛋白酶活性位点和19S调节颗粒,其将适当的底物识别并转移到CP腔中进行分解。调节蛋白酶体活性以维持蛋白酶抑制以响应内部和外部条件的波动。我们最近显示,UPS涉及植物免疫的几个方面,一系列植物和动物病原体颠覆了UPS来增强其毒力(Üstünet al。,2013;üstünet al。,2014;ÜstünandBörnke,2015 ;Üstünet ...
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