| Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Myogenesis is a multi-step process that leads to the formation of skeletal muscle during embryonic development and repair of injured myofibers. In this process, myoblasts are the main effector cell type which fuse with each other or to injured myofibers leading to the formation of new myofibers or regeneration of skeletal muscle in adults. Many steps of myogenesis can be recapitulated through in vitro differentiation of myoblasts into myotubes. Most laboratories use immortalized myogenic cells lines that also differentiate into myotubes. Although these cell lines have been found ...
[摘要] 造血是一种多步骤过程，导致在损伤的肌纤维的胚胎发育和修复期间骨骼肌的形成。在这个过程中，成肌细胞是主要的效应细胞类型，彼此融合或损伤肌纤维，导致新成肌纤维的形成或成年人骨骼肌的再生。通过体外成骨细胞分化成肌管可以概括出许多发生肌肉发育的步骤。大多数实验室使用也分化成肌管的永生化肌原细胞系。虽然已经发现这些细胞系对于描绘造血的调节机制非常有用，但是它们通常依赖于细胞的来源和培养条件而显示出很大的变异性。原代成肌细胞被认为是体外研究肌生成的最生理学相关模型。然而，由于成体骨骼肌的丰度低，原代成肌细胞的分离在技术上是有挑战性的。在本文中，我们描述了一种用于从小鼠的成年骨骼肌分离原代成肌细胞的改进方案。我们还描述了其培养和分化成肌管的方法。
背景 造血是一个复杂而高度协调的过程，其涉及多潜能中胚层细胞的测定，以产生成肌细胞，成肌细胞从细胞周期中排出，以及它们最终分化为骨骼肌纤维。 Myogen-5，MyoD，myogenin和MRF4的基因螺旋 - 环 - 螺旋转录因子的一组基因调控因子（MRFs）的顺序表达调控。 Myf-5和MyoD是成肌细胞形成，增殖和存活所需的主要MRFs，而其他MRF（如肌细胞生成素和MRF-4）在肌发生过程中起作用迟发，激活收缩蛋白和其他结构和代谢蛋白的基因表达（白金汉，2003; ...
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| Immunostaining of Formaldehyde-fixed Metaphase Chromosome from Untreated and Aphidicolin-treated DT40 Cells
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] During mitosis chromosomes are condensed into dense X-shaped structures that allow for microscopic determination of karyotype as well as inspection of chromosome morphology.
This protocol describes a method to perform immunostaining of formaldehyde-fixed metaphase chromosomes from the avian cell line DT40. It was developed to characterize the localization of YFP-tagged TopBP1 on mitotic chromosomes and specifically determine the percentage of TopBP1 foci that formed on breaks/gaps as well as ends of individual metaphase macrochromosomes (Pedersen et al., 2015). For this ...
[摘要] 在有丝分裂期间，染色体被浓缩成致密X型结构，允许显微检测染色体核型和检查染色体形态。
该方案描述了从禽细胞系DT40进行甲醛固定的中期染色体的免疫染色的方法。 它被开发用于表征YFP标记的TopBP1在有丝分裂染色体上的定位，并且具体确定形成于断裂/间隙以及单个中期大染色体末端的TopBP1灶的百分比（Pedersen等，2015）。 为此，应用YFP的免疫染色。 然而，该协议可以针对其他细胞系或表位进行优化。
【背景】染色中期染色体的显微镜分析是经典的细胞遗传学技术，广泛用于研究和诊断。基本原理包括通过锭子不稳定试剂如谷氨酸诱导中期细胞周期停滞，这将触发主轴装配检查点，从而阻止细胞在中期。这用于富集浓缩染色体的细胞。随后将细胞在低渗溶液中进行溶胀，然后在显微镜载玻片上铺展有丝分裂细胞。最终结果是来自单细胞的显微镜检测染色体，便于染色体核型分析以及个体染色体的研究。传统上，肿胀的细胞用甲醇和乙酸（3:1）固定，然后铺展在载玻片上（Hungerford，1965; Ronne等，1979）。
这里描述的方法使用甲醛而不是甲醇进行固定。这可以用于随后用与甲醇固定不相容的抗体染色。该方案针对鸡DT40细胞的中期传播进行了优化，YFP标记的TopBP1在中期大染色体上的免疫染色（Pedersen等，2015）。 ...
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| Evaluation of Plasmid Stability by Negative Selection in Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Plasmid stability can be measured using antibiotic-resistance plasmid derivatives by positive selection. However, highly stable plasmids are below the sensitivity range of these assays. To solve this problem we describe a novel, highly sensitive method to measure plasmid stability based on the selection of plasmid-free cells following elimination of plasmid-containing cells. The assay proposed here is based on an aph-parE cassette. When synthesized in the cell, the ParE toxin induces cell death. ParE synthesis is controlled by a rhamnose-inducible promoter. When bacteria carrying the aph-parE ...
[摘要] 可以通过阳性选择使用抗生素抗性质粒衍生物来测量质粒稳定性。然而，高度稳定的质粒低于这些测定的灵敏度范围。为了解决这个问题，我们描述了一种新颖的，高度灵敏的方法来测量质粒稳定性，这是基于在含有质粒的细胞消除后，无质粒细胞的选择。这里提出的检测方法是基于aph-parE 盒式磁带。当细胞合成时，ParE毒素诱导细胞死亡。 ParE合成由鼠李糖诱导型启动子控制。当携带 aph-parE 模块的细菌生长在含有鼠李糖作为唯一碳源的培养基中时，合成ParE，消除含有质粒的细胞。进一步使用卡那霉素抗性（ aph ）来证实在鼠李糖生长的细菌中不存在质粒。
背景 通过使用抗生素抗性质粒衍生物的阳性选择测定质粒稳定性。携带研究质粒的细胞在选择性抗生素（Gerdes等人，1985; del Solar等人，1987）的存在下被阳性选择。这种技术的主要缺点是其灵敏度;高度稳定的质粒低于这些测定的敏感性。为了解决这个问题，已经描述了依靠直接选择无质粒细胞例如 - 四环素系统的替代方法（Bochner等人，1980; Maloy和Nunn，1981; Garcia-Quintanilla 等人，2006）。 - ...
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